Razlika između kloniranja gena i PCR-a
Share
Ključna razlika - kloniranje gena i PCR
Sinteza mnogih kopija DNK iz određenog fragmenta DNA naziva se amplifikacija DNA. Postoje dva glavna procesa amplifikacije DNA, naime kloniranje gena i PCR. Ključna razlika između kloniranja gena i PCR je, kloniranjem gena nastaje višestruka kopija određenog gena in vivo konstruirajući rekombinantnu DNK i raste unutar bakterije domaćina, dok PCR stvara milijune primjeraka određenog fragmenta DNA in vitro prolazeći ponavljane cikluse denaturacije i sinteze.
SADRŽAJ
1. Pregled i ključne razlike
2. Što je gensko kloniranje
3. Što je PCR
4. Usporedna usporedba - kloniranje gena i PCR
5. Sažetak
Što je gensko kloniranje?
Kloniranje gena je tehnika koja se koristi za lociranje i umnožavanje određenog gena iz izvađene genomske DNK u organizmu konstrukcijom rekombinantne DNA. Genomska DNA sadrži tisuće različitih gena kodiranih za proteine. Kad se DNK izdvoji, uključuje sve moguće gene koje može nositi. Tehnika kloniranja gena omogućila je otkrivanje određenog gena iz ukupne DNK. Stoga je kloniranje gena važno sredstvo u molekularnoj biologiji.
Stvaranje genomske biblioteke organizma od presudnog je značaja za kloniranje gena ako nema pojma o mjestu relevantnog gena u DNK. Genomska biblioteka izrađuje se pomoću sljedećih koraka.
Korak 1: Ekstrakcija cjelokupne DNA iz organizma koji sadrži željeni gen.
Korak 2: Restriktivna probava ekstrahirane DNA kako bi se dobili mali upravljački fragmenti. Ovaj korak je olakšan restrikcijskim endonukleazama.
3. korak: Odabir pogodnog vektora i otvaranje vektorske DNA pomoću iste restrikcijske endonukleze. Bakterijski plazmidi se obično koriste kao vektori za nošenje strane DNK. Plazmidi su mali krugovi DNK smješteni unutar bakterija.
4. korak: Kombinacija vektorske DNK i fragmentirane DNA za proizvodnju rekombinantne molekule DNA. Ovim korakom upravlja DN ligaza.
Korak 5: Prijenos rekombinantnih molekula DNA u bakterije domaćine. Ovaj korak poznat je kao transformacija, a provodi se upotrebom toplinskog udara.
Korak 5: Pregled transformiranih bakterijskih stanica na mediju kulture. Na kraju procesa transformacije dobiva se miješana populacija transformiranih i netransformiranih stanica domaćina. Kako interesni gen uključuje samo transformirane stanice domaćina. Stoga je potrebno odabrati transformirane stanice. Odabir se vrši korištenjem selektivnih medija koji sadrže antibiotike. Samo transformirane stanice rastu na ovom mediju za provjeru što omogućava selekciju.
Korak 6: Uzgoj bakterija za proizvodnju genske biblioteke. U ovom koraku, transformirane stanice domaćina uvode se u svježi medij kulture što osigurava optimalne potrebe za rastom. Ukupne kolonije na pločama s kulturom predstavljaju genomsku biblioteku tog organizma.
Korak 7: Rekombinantna molekula DNA koja sadrži gen koji nas zanima mora biti ispitana iz tisuća kloniranih fragmenata rekombinantne DNA. To se može postići primjenom sondi koje obilježavaju specifični gen ili specifične proteine koji nastaju iz tog gena.
Jednom kada se zainteresirani gen koji sadrži bakterijsku koloniju identificira iz ukupnih kolonija, moguće je napraviti milijune primjeraka rekombinantnog plazmida koji sadrži gen.
Kloniranje gena koristi se pri uspostavljanju biblioteka gena, proizvodnji posebnih proteina, vitamina, antibiotika, hormona, sekvenciranju i mapiranju genoma organizma, izrađivanju višestrukih kopija DNK pojedinaca u forenzičkim medicinama itd..
Slika_1: Kloniranje gena
Što je PCR?
Lančana reakcija polimeraze (PCR) je tehnika koja stvara velik broj kopija određenog fragmenta DNA. Eksponencijalno pojačavanje specifične sekvence DNA dobiveno je PCR pod in vitro Uvjeti. Ova je tehnika vrlo moćan alat u molekularnoj biologiji jer može umnožiti mali uzorak DNA u iskoristivu količinu. PCR je uveo Kary Mullis 1983. godine, a ovaj nagradni izum stvorio je ogroman napredak u molekularnoj biologiji.
PCR tehnika slijedi ponovljene PCR reakcije kao što je prikazano na slici 02. Jedna PCR reakcija sastoji se od tri glavna koraka koji se odvijaju pri tri različite temperature; denaturiranje dvolančane DNA na 94 0C, žarenje primera na 68 0C i produžetak žice na 72 0C. Stoga, kada se provodi PCR, treba održavati fluktuaciju temperature za pravilnu replikaciju. PCR se izvodi u PCR stroju unutar PCR epruveta. PCR epruvete učitavaju se ispravnim PCR smjesama koje sadrže šablonsku DNK, Taq polimerazu, primere, dNTP i pufer. Denaturanost dvolančane DNK uzorka u jednolančane DNK vrši se razbijanjem vodikovih veza između komplementarnih baza na 94 - 98 0C. Potom su pojedini lanci DNA šablone izloženi temeljnim slojevima. Treba osigurati par prajmera (naprijed i natrag), koji bi trebali biti termostabilni da podnose visoke temperature. Primeri su jednolančani kratki DNK nizovi komplementarni krajevima ciljanog DNK fragmenta. U PCR se koriste sintetski primeri. Primeri se vežu s komplementarnim bazama DNA uzorka i započinju sintezu novog lanca. Taj korak katalizira enzim nazvan Taq polimeraza; termostabilni enzim DNK polimeraza izoliran iz Thermus auqaticus. Kad su dostupni prajmeri i nukleotidi (građevni blokovi), Taq polimeraza konstruira novi lanac DNK komplementaran DNA DNK-u. Na kraju PCR programa uočen je amplificirani fragment DNA pomoću gel elektroforeze. Ako je potrebna daljnja analiza, PCR proizvod se pročisti iz gela.
PCR je vrlo koristan za dijagnosticiranje i praćenje genetskih i stečenih bolesti, identifikaciju kriminalaca (u području forenzike), proučavanje strukture i funkcije ciljanog segmenta DNK, sekvenciranje i mapiranje genoma organizma itd. PCR je postao rutinska laboratorijska tehnika u znanstvenim laboratorijima medicinske i molekularne biologije, jer ima široku primjenu.
Slika_2: Lančana reakcija polimeraze
Koja je razlika između kloniranja gena i PCR-a?
Gene Cloning vs PCR | |
| Kloniranje gena postupak je stvaranja višestrukih kopija određenog gena in vivo putem rekombinantne DNA i pretvaranja u bakteriju domaćina. | PCR tehnika proizvodi više kopija određenog sekvence DNA in vitro kroz ponovljene cikluse PCR reakcija. |
| Zahtjev konstruiranja rekombinantne DNA | |
| Rekombinantna DNA nastaje kako bi se locirao gen. | Rekombinantna DNA se ne proizvodi. |
| Potreba rada | |
| Ovaj je proces intenzivan. | Intenzivna radna snaga nije potrebna. |
| In vivo ili In vitro postupak | |
| Izgradnja rekombinantne DNA je in vitro a amplifikacija DNA je in vivo. | Pojačanje DNK događa se u potpunosti in vitro. |
Rezime - Gene Cloning vs PCR
Kloniranje gena i PCR dvije su metode koje se koriste za amplifikaciju DNA. PCR je an in vitro postupak koji čini više kopija DNK određenog fragmenta DNA bez upotrebe rekombinantne DNK i organizma domaćina. Kloniranje gena je prije svega an in vivo postupak koji rezultira u više kopija zainteresiranog gena u organizmu domaćina izgradnjom rekombinantne DNA. Ovo je razlika između kloniranja gena i PCR-a.
Referenca:
1. Griffiths, Anthony JF. "Kloniranje određenog gena." Suvremena genetska analiza. Američka nacionalna medicinska knjižnica, 01. siječnja 1999. Web. 22. veljače 2017
2. "Lančana reakcija polimeraze (PCR)." Nacionalni centar za biotehnološke informacije. Američka nacionalna medicinska knjižnica, n.d. Mreža. 22. veljače 2017
Ljubaznošću slike:
1. "Slika 17 01 06" CNX OpenStax - (CC BY 4.0) putem Commons Wikimedia
2. "PCR" Madprime - Vlastiti rad (CC BY-SA 3.0) putem Commons Wikimedia
