Razlika između NGS i Sanger Sequisting

Ključna razlika - NGS vs Sanger Sequisting
 

Sljedeća generacija sekvenciranja (NGS) i Seger Sekvenciranje su dvije vrste nukleotidnih sekvencijalnih tehnika razvijenih tijekom vremena. Metoda Sanger Sequisting široko se koristi dugi niz godina, a NGS ju je nedavno zamijenio zbog svojih prednosti. Ključna razlika između NGS i Sanger Sequencing je ta NGS djeluje na principu sekvenciranja milijuna sekvenci istovremeno brzim sustavom sekvenciranja, dok Sanger Sequencing djeluje na glavnom prekidu lanca zbog selektivne ugradnje dideoksinukleotida enzimom DNA polimeraze tijekom replikacije DNK i rezultiranja razdvajanjem fragmenata kapilarom elektroforeza.

SADRŽAJ
1. Pregled i ključne razlike
2. Što je nukleotidno sekvencioniranje
3. Što je NGS
4. Što je sigurnije sekvenciranje
5. Usporedna usporedba - NGS vs Sanger Sequisting
6. Sažetak

Što je nukleotidno sekvencioniranje?

Genetske informacije pohranjuju se u nukleotidne sekvence DNA ili RNA organizma. Proces utvrđivanja ispravnog redoslijeda nukleotida (pomoću četiri baze) u određenom fragmentu (u genu, grupi gena, kromosomu i kompletnom genomu) poznat je kao nukleotidno sekvencioniranje. Vrlo je važno u genskim studijama, forenzičkim studijama, virologiji, biološkom sustavnom, medicinskom dijagnozi, biotehnologiji i na mnogim drugim područjima analizirati strukturu i funkciju gena. Postoje različite vrste slijeda koje su razvili znanstvenici. Među njima, Sigurnije sekvenciranje razvijen od Fredericka Sangera 1977. godine, široko se koristio i popularizirao kroz dugo razdoblje Redoslijed slijedeće generacije zamijenio je.

Što je NGS?

Sljedeća generacija sekvenciranja (NGS) je pojam koji se koristi za označavanje modernih procesa sekvenciranja visoke propusnosti. Opisuje niz različitih modernih tehnologija slijeda koje su revolucionirale genomske studije i Molekularnu biologiju. Te tehnike su Illumina sekvenciranje, Roche 454 sekvenciranje, Ionsko protonsko sekvenciranje i SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection) sekvenciranje. NGS sustavi su brži i jeftiniji. Četiri glavne metode sekvenciranja DNA koriste se u NGS sustavima, naime; pirokvencioniranje, sekvenciranje sintezom, sekvenciranje vezanjem i ionskim poluvodičkim sekvenciranjem. Veliki broj nizova DNA ili RNA (u milijunima) može se paralelno sekvencirati. Omogućuje sekvenciranje cjelokupnog genoma organizma u kratkom vremenskom razdoblju, za razliku od Sangerove sekvence koja zahtijeva više vremena.

NGS ima mnogo prednosti u odnosu na konvencionalnu Sanger-ovu metodu sekvenciranja. To je brzi, precizniji i isplativiji postupak koji se može izvesti s malom veličinom uzorka. NGS se može koristiti u metagenomskim studijama, u otkrivanju varijacija unutar pojedinog genoma uslijed umetanja i brisanja itd. I u analizi genskih ekspresija.

Slika_1: Događaji u sekvenciranju NGS-a

Što je sigurnije sekvenciranje?

Sanger Sequencing je metoda sekvenciranja koju su razvili Frederick Sanger i njegovi kolege 1977. kako bi odredili precizni redoslijed nukleotida određenog fragmenta DNA. Poznat je i kao redoslijed prekida lanca ili Dideoksi sekvence. Princip rada ove metode je prekid sinteze lanaca selektivnim ugradnjom lanca koji završavaju dideoksinukleotide (ddNTP) kao što su ddGTP, ddCTP, ddATP i ddTTP pomoću DNA polimeraze tijekom replikacije DNK. Normalni nukleotidi imaju 3 'OH skupine za stvaranje fosfodiesterske veze između susjednih nukleotida kako bi nastavili stvaranje lanaca. Međutim, ddNTP-ovima nedostaje ova 3 'OH grupa i ne mogu formirati fosfodiesterske veze između nukleotida. Dakle, produženje lanca je zaustavljeno.

U ovoj metodi jednolančana DNK koja će biti sekvencirana služi kao predložak za predložak in vitro Sinteza DNA. Ostali zahtjevi su oligonukleotidni prajmer, prekursori deoksinnukleotida i enzim DNK polimeraze. Kad su poznati bočni krajevi ciljanog fragmenta, početnici se lako dizajniraju za replikaciju DNK. Četiri odvojene reakcije sinteze DNA provode se u četiri odvojene epruvete. Svaka cijev ima zasebne ddNTP-ove, zajedno s ostalim zahtjevima. Iz pojedinog nukleotida dodaje se mješavina dNTP-a i ddNTP-a. Isto tako, četiri odvojene reakcije provode se u četiri epruvete s četiri smjese. Nakon reakcija provodi se detekcija fragmenata DNA i pretvaranje uzorka fragmenta u informacije o sekvenci. Rezultirajući fragmenti DNK toplotno su denaturirani i razdvojeni gel elektroforezom. Ako se koriste radioaktivni nukleotidi, obrazac vezivanja u poliakrilamidnom gelu može se vizualizirati autoradiografijom. Kada se u ovoj metodi koriste fluorescentno označeni dideoksinukleotidi, ona se može ublažiti dolje očitanim gelom i proći kroz lasersku zraku da bi ga fluorescentni detektor otkrio. Kako bi se izbjegle pogreške koje bi mogle nastati kada se očita niz i ručno unese u računalo, ova se metoda razvila u upotrebu automatiziranog sekvencera zajedno s računalom..

Ovo je metoda koja se koristi za sekvenciranje DNK iz projekta Ljudski genom. Ova se metoda još uvijek koristi s naprednim modifikacijama, jer daje točne informacije o slijedu iako je skup i spor proces.

Slika_2: Sigurnije sekvenciranje

Koja je razlika između NGS i Sanger Sequisting?

NGS vs Sanger Sequisting
Redoslijed slijedeće generacije (NGS) odnosi se na moderne procese sekvenciranja visoke propusnosti. Opisuje niz različitih modernih tehnologija slijeda	Sanger Sequencing je metoda sekvenciranja koju je razvio Frederick Sanger kako bi odredio precizni redoslijed nukleotida danog fragmenta DNA..
Isplativost
NGS je jeftiniji postupak jer smanjuje vrijeme, ljudsku snagu i kemikalije.	Ovo je skup proces jer treba vremena, ljudske snage i više kemikalija.
Ubrzati
Ovo je brže jer se i kemijska detekcija i otkrivanje signala kod mnogih niti odvijaju paralelno.	Ovo zahtijeva puno vremena jer se kemijsko otkrivanje i otkrivanje signala događaju kao dva odvojena procesa i istovremeno se mogu čitati samo na cjedilu.
Pouzdanost
NGS je pouzdan.	Sigurno sekvenciranje je manje pouzdano
Veličina uzorka
NGS zahtijeva manju količinu DNK.	Ova metoda treba veliku količinu DNA predloška.
DNK baze po sekvenciranom fragmentu
Broj DNK baza po sekvenciranom fragmentu manji je od Sangerove metode	Generiranje sekvenci je dulje od NGS sekvenci.

Sažetak - NGS vs Sanger Sequisting

NGS i Seger Sequencing su tehnike nukleotidnog sekvenciranja koje se široko koriste u molekularnoj biologiji. Sanger sekvenciranje je rana metoda sekvenciranja koja je zamijenjena NGS. Glavna razlika između NGS i Sanger Sequistinga je u tome što je NGS brzi, precizniji i isplativiji proces od Sangerovog sekvenciranja. Obje su tehnike stvorile velike epidemije u genetici i biotehnologiji.

Referenca:
1. Nowrousian, Minou. "Tehnike sekvenciranja sljedeće generacije za eukariotske mikroorganizme: rješenja baziranih na sekvenciranju bioloških problema." Eukariotska stanica. Američko društvo za mikrobiologiju, rujan 2010. Web. 18. veljače 2017
2. Sanger, F., S. Nicklen i A. R. Coulson. "Sekvenciranje DNK s inhibitorima zaustavljanja lanca." Zbornik radova Nacionalne akademije znanosti 74.12 (1977): 5463-467. mreža.
3. Liu, Lin, Yinhu Li, Siliang Li, Ni Hu, Yimin He, Ray Pong, Danni Lin, Lihua Lu i Maggie Law. "Usporedba sustava za slijeđenje nove generacije." Časopis za biomedicinu i biotehnologiju 2012 (2012): 1-11. mreža.

Ljubaznošću slike:
"Sanger-sequiting" Estevezj - Vlastiti rad (CC BY-SA 3.0) putem Commons Wikimedia 
“Razvoj u slijedećim redovima sljedeće generacije” autor Nederbragt, Lex (2012) - (CC BY 3.0) preko Commons Wikimedia