Razlika između sigurnijeg sekvenciranja i pirokastinga

Ključna razlika - sigurnije sekvenciranje u odnosu na pirokasting
 

DNK sekvenciranje vrlo je važno za DNK analizu jer znanje o ispravnom rasporedu nukleotida na određenoj DNK regiji otkriva mnoge važne podatke o tome. Postoje različite metode sekvenciranja DNK. Sanger sekvence i Pyrosequences su dvije različite metode sekvenciranja DNA koje se široko koriste u molekularnoj biologiji. Ključna razlika između Sanger sekvenciranja i Pyrosequences je ta Sanger sekvenciranje koristi dideoksinukleotide da prekine sintezu DNA za čitanje nukleotidne sekvence dok pirokvencioniranje otkriva otpuštanje pirofosfata ugradnjom nukleotida i sintetizacijom komplementarne sekvence da bi se pročitao precizan redoslijed slijeda.

SADRŽAJ
1. Pregled i ključne razlike
2. Što je sigurnije sekvenciranje
3. Što je piroakcija
4. Usporedna usporedba - sigurnije sekvenciranje u odnosu na pirokasting
5. Sažetak

Što je sigurnije sekvenciranje?

Sanger sekvenciranje je prva metoda generiranja DNK prve generacije koju su razvili Frederick Sanger i njegovi učilišta 1977. Također je poznata kao Završavanje lančanog raskida ili Dideoksi sekvence jer se temelji na prestanku lanca dideoksinukleotidima (ddNTP). Ova se metoda široko koristila više od 30 godina dok se nije razvio novi naraštaj sekvence (NGS). Sanger tehnika sekvenciranja omogućila je otkrivanje ispravnog nukleotidnog reda ili spajanje određenog fragmenta DNA. Temelji se na selektivnom uključivanju ddNTP-a i prekidu sinteze DNA tijekom in vitro Replikacija DNA. Nepostojanje 3 'OH skupina za nastavak stvaranja fosfodiesterske veze između susjednih nukleotida jedinstveno je obilježje ddNTP-a. Stoga, nakon što je spojen ddNTP, produženje lanca prestaje i prestaje od te točke. Postoje četiri ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP i ddTTP - koji se koriste u Sanger sekvenciranju. Ti nukleotidi zaustavljaju proces replikacije DNK kada su ugrađeni u rastući lanac DNK i rezultiraju različitim duljinama kratke DNK. Kapilarna gel elektroforeza koristi se za organiziranje ovih kratkih lanaca DNA po njihovim veličinama na gelu kao što je prikazano na slici 01.

Slika 1: Elektroforeza kapilarnog gela sintetiziranog kratkog DNK

Za in vitro repliciranje DNA, treba osigurati nekoliko zahtjeva. To su enzim DNK polimeraze, predloška DNA, oligonukleotidni prajmeri i deoksinukleotidi (dNTP). U Sanger sekvenciranju, replikacija DNA provodi se u četiri odvojene epruvete, zajedno s četiri vrste ddNTP-ova odvojeno. Deoksinnukleotidi nisu u potpunosti zamijenjeni odgovarajućim ddNTP-ovima. Smjesa određenog dNTP-a (na primjer; dATP + ddATP) je uključena u epruvetu i replicirana. Četiri odvojena proizvoda s cijevima izvode se na gelu u četiri odvojene jažice. Zatim se čitanjem gela može konstruirati slijed kao što je prikazano na slici 02.

Slika 02: Sigurnije sekvenciranje

Sanger sekvenciranje važna je tehnika koja pomaže u mnogim područjima molekularne biologije. Projekt ljudskog genoma uspješno je dovršen pomoću Sangerovih metoda temeljenih na sekvenciranju. Sigurno sekvenciranje je također korisno u ciljanom sekvenciranju DNK, istraživanju raka i genetskih bolesti, analizi ekspresije gena, identifikaciji čovjeka, otkrivanju patogena, sekvenciranju mikroba itd..

Postoji nekoliko nedostataka Sanger-ova redoslijeda:

• Duljina DNK koja je sekvencirana ne može biti veća od 1000 parova baza
• Istodobno se može sekvencirati samo jedan pramen.
• Proces je dugotrajan i skup.

Zbog toga su s vremenom razvijene nove napredne tehnike slijeđenja za prevladavanje ovih problema. Međutim, Sanger sekvenciranje se još uvijek koristi zbog svojih vrlo točnih rezultata do približno 850 fragmenata duljine osnovnog para.

Što je Pyrosequences?

Pirokvencioniranje je nova tehnika sekvenciranja DNA koja se temelji na "sekvenciranju sintezom". Ova se tehnika oslanja na otkrivanje otpuštanja pirofosfata nakon ugradnje nukleotida. U procesu se koriste četiri različita enzima: DNA polimera, ATP sulfurilaza, luciferaza i apiraza te dva supstrata adenozin 5 'fosfosulfata (APS) i luciferin.

Proces započinje vezanjem prajmera s jednolančanim DNK obrascem, a DNA polimeraza započinje s ugradnjom komplementarnih nukleotida. Kad se nukleotidi spoje (polimerizacija nukleinskih kiselina), oslobađa se pirofosfatne (dvije fosfatne skupine povezane) i grupe. Svaki dodatak nukleotida oslobađa ekvimolarnu količinu pirofosfata. Pirofosfat se pretvara u ATP pomoću ATP sulfurlaze u prisutnosti APS supstrata. Stvoreni ATP pokreće pretvorbu luciferina-luciferina u oksiluciferin, stvarajući vidljivu svjetlost u količinama koje su proporcionalne količini ATP-a. Svjetlost otkriva fotonski uređaj za otkrivanje fotona ili fotomultiplikator i stvara pirogram. Apiraza razgrađuje ATP i nekorišteni dNTP u reakcijskoj smjesi. dodavanje dNTP-a vrši se jedan po jedan. Budući je poznato dodavanje nukleotida prema uključivanju i detekciji svjetlosti, može se odrediti redoslijed predloška. Pirogram se koristi za stvaranje nukleotidne sekvence DNA uzorka kao što je prikazano na slici 03.

Pirokvencioniranje je vrlo važno u analizi polimorfizma s jednim nukleotidom i sekvenciranju kratkih proteza DNA. Visoka preciznost, fleksibilnost, jednostavnost automatizacije i paralelna obrada prednosti su pirocikliranja u odnosu na Sanger tehnike sekvenciranja.

Slika 03: Piroakcija

Koja je razlika između sigurnijeg sekvenciranja i pirokastinga?

Sanger Sequisting vs Pyrosequences
Sanger sekvenciranje je metoda sekvenciranja DNA koja se temelji na selektivnom uključivanju ddNTP-ova DNA polimerazom i prekidom lanca.	Piroknjiženje je metoda sekvence DNA koja se temelji na otkrivanju otpuštanja pirofosfata nakon ugradnje nukleotida.
Upotreba ddNTP-a
Za prekid replikacije DNA koriste se ddNTP-ovi	ddNTP se ne koriste.
Enzimi koji su uključeni
Koristi se DNK polimeraza.	Koriste se četiri enzima: DNK polimeraza, ATP sulfurilaza, Luciferaza i Apiraza.
Korištene podloge
APS i Luciferin se ne koriste.	Koristi se adenosin 5 'fosfosulfat (APS) i luciferin.
Maksimalna temperatura
Ovo je spor proces.	Ovo je brz proces.

Sažetak - Sigurnije sekvenciranje u odnosu na pirokasting

Sanger sekvence i Pyrosequences su dvije metode sekvenciranja DNA koje se koriste u molekularnoj biologiji. Sanger sekvenciranje konstruira redoslijed nukleotida u slijedu zaustavljanjem produženja lanca, dok pirokvencioniranje konstruira precizan redoslijed nukleotida u slijedu ugradnjom nukleotida i otkrivanjem oslobađanja pirofosfata. Stoga je glavna razlika između Sanger sekvenciranja i Pyrosequences u tome što Sanger sekvenciranje djeluje na sekvenciranje prekidom lanca, dok pirokvencioniranje djeluje na sekvenciranje sintezom.

Referenca:
1. Fakruddin, Md, i Abhijit Chowdhury. "Piroakviranje - alternativa tradicionalnom sigurnijem sekvenciranju." Američki časopis za biokemiju i biotehnologiju. Znanstvene publikacije, 02. ožujka 2012. Web. 28. veljače 2017.
2. "Sigurnije sekvenciranje." Zasigurno sekvenciranje - ScienceDirect teme. N.p., n.d. Mreža. 28. veljače 2017

Ljubaznošću slike:
1. "Didesoxy-Metode" Christoph Goemans (modifiziert) - dr. Norman Mauder, auf Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) putem Commons Wikimedia
2. "Sanger-DNA-seq" napisao Enzo na Wikipediji na poljskom jeziku (CC BY-SA 3.0) putem Commons Wikimedia
3. "Piroaktivacija" mikrobiobajkovima (CC BY-SA 2.0) putem Flickr-a