Razlika između PCR i DNA sekvenciranja

Ključna razlika - PCR vs DN sekvence
 

PCR i DNA sekvenciranje dvije su važne tehnike u molekularnoj biologiji. Lančana reakcija polimeraze (PCR) proces je koji stvara veliki broj kopija fragmenta DNA. Sekvenciranje DNA je tehnika koja rezultira u preciznom redoslijedu nukleotida određenog DNK fragmenta. Ovo je ključna razlika između PCR i DNA sekvenciranja. PCR je jedan od glavnih koraka u sekvenciranju DNK.

SADRŽAJ
1. Pregled i ključne razlike
2. Što je PCR
3. Što je DNK sekvenciranje
4. Usporedna usporedba - PCR vs DNA Sekvenciranje
5. Sažetak

Što je PCR?

Lančana reakcija polimeraze (PCR) tehnika je amplifikacije DNA koja se koristi u molekularnoj biologiji. Proizvodi tisuće do milijune primjeraka određenog fragmenta DNA. Ovu je metodu razvio Kary Mullis 1983. U ovoj tehnici, fragment DNA koji će se amplificirati služi kao predložak, a enzim DNK polimeraza dodaje komplementarne nukleotide prajmeru koji je dostupan u PCR smjesi. Na kraju PCR reakcije sintetizirane su mnoge kopije uzorka DNA.

Postoje različite komponente PCR smjese, uključujući DNK, DNK polimerazu (Taq polimeraza), prajmere (prednji i reverzni prajmeri), nukleotide (gradivne blokove DNK) i pufer. PCR se događa unutar PCR stroja, i ispravna PCR smjesa treba biti umetnuta u stroj, a pravi program treba pokretati. Ova tehnika omogućuje proizvodnju od tisuće do milijuna primjeraka određenog dijela DNK iz vrlo male količine DNK.

PCR reakcije se odvijaju ciklično, čime se stvara vidljiva količina PCR proizvoda na gelu. Tri su glavna koraka uključena u PCR reakciju, a to su denaturacija, ispiranje prajmera i produženje niti kao što je prikazano na slici 01. Ova tri koraka se odvijaju na tri različite temperature. DNK postoje u dvolančanom obliku vodikovim vezama između komplementarnih baza. Prije implikacije, dvolančani DNK trebaju se odvojiti jedan od drugog. To se vrši davanjem visoke temperature. Pri visokoj temperaturi, dvostruka denatura DNA u jednostruke. Tada se temeljni premazi trebaju približiti bočnim krajevima određenog fragmenta ili gena DNA. Primer je kratki komad jednolančane DNK koji je komplementaran ciljnom slijedu. Prednji i reverzni prajmeri se žare s komplementarnim bazama na bočnim krajevima denaturiranog uzorka DNA pri temperaturi žarenja. Temeljni premazi trebaju biti otporni na toplinu. Nakon što se primeri liječe uzorkom DNA, enzim taq polimeraze pokreće sintezu novih lanaca dodavanjem nukleotida koji su komplementarni ciljanoj DNK. Taq polimeraza je toplinski stabilan enzim izoliran iz termofilne bakterije zvane Thermus aquaticus. PCR pufer održava optimalne uvjete za djelovanje taq polimeraze. Ova tri stadija PCR reakcija se ponavljaju da bi se dobila potrebna količina PCR produkta. Nakon svake PCR reakcije, broj kopija DNK se udvostručuje. Stoga se u PCR-u može primijetiti eksponencijalno pojačanje. PCR proizvodi mogu se promatrati uporabom gel elektroforeze i mogu se pročistiti za daljnja ispitivanja.

Slika 01: Glavni koraci PCR reakcije

PCR je vrijedan alat u medicinskim i biološkim istraživanjima. PCR ima posebnu vrijednost u forenzičkoj znanosti jer može pojačati DNK za studije iz sitnih uzoraka kriminalaca i napraviti forenzičke DNK profile. PCR se široko koristi u mnogim područjima molekularne biologije, uključujući genotipizaciju, kloniranje gena, detekciju mutacija, sekvenciranje DNA, mikroračunate DNA i testiranje očinstva itd..

Slika 02: Lančana reakcija polimeraze

Što je DNK sekvenciranje?

Redoslijed DNK je određivanje preciznog poretka nukleotida - adenina, gvanina, citozina i timina u određenom fragmentu DNK. Genetske informacije pohranjuju se u DNK sekvence koristeći ispravan redoslijed nukleotida. Stoga je pronalaženje preciznog redoslijeda nukleotida u fragmentu DNA vrlo važno znati strukturu i funkciju gena.

Protokol sekvenciranja DNK uključuje različite procese. Prvi korak je izolacija zainteresirane DNK ili genomske DNA organizma. Pomoću PCR-a (kao što je gore opisano), potrebno je amplificirati željenu regiju DNA. Pojačani PCR proizvod treba odvojiti gel elektroforezom i pročistiti. Pojačani fragmenti služe se kao predlošci za sekvenciranje. Sekvenciranje se može obaviti ili po Sanger sekvenciranju ili metodi sekvenciranja s velikom propusnošću. Sigurno sekvenciranje zahtijeva kapilarnu elektroforezu rezultirajućih fragmenata DNA. Određivanje ispravnog redoslijeda nukleotida može se izvršiti ručnim čitanjem autoradiografa ili korištenjem automatiziranih DNK sekvencera.

Sekvenciranje gena pridonijelo je projektu Ljudski genom i olakšalo mapiranje ljudskog genoma 2003. godine. U forenzičkim analizama DNK sekvenciranje omogućilo je identifikaciju pojedinaca koji pokazuju jedinstvene sekvence DNK i identificirali kriminalce. U medicini se sekvenciranje DNA može koristiti za otkrivanje gena odgovornih za genetske i druge bolesti, pronalaženje gena s defektima i njihovo zamjena s ispravnim genima. U poljoprivredi se informacije o sekvenciranju DNK nekih mikroorganizama koriste za proizvodnju transgenih kultura s ekonomski željenim karakteristikama.

Slika 03: Sekvenciranje DNK

Koja je razlika između PCR i DNA sekvence?

PCR vs DN sekvence
PCR postupkom stvara se tisućama do milijunima primjeraka zainteresiranog fragmenta DNA.	Sekvenciranje DNK postupak je određivanja preciznog redoslijeda nukleotida u određenom fragmentu DNA.
Ishod
PCR stvara tisuće do milijune primjeraka određenog fragmenta DNA	To rezultira ispravnim redoslijedom baza u određenom fragmentu DNA.
Uključivanje ddNTP-ova
PCR ne zahtijeva ddNTP. Koristi dNTP.	Za sekvenciranje DNK potrebni su DDNTPs za prekid formiranja niti.

Sažetak - PCR vs DN sekvence

PCR i DNA sekvenciranje vrlo su važni alati u mnogim područjima molekularne biologije. Amplifikacija DNK fragmenata provodi se PCR tehnikom dok je ispravan redoslijed nukleotida DNA fragmenta određen DNK sekvenciranjem. Ovo je razlika između PCR i DNA sekvence.

Referenca:
1. "Lančana reakcija polimeraze (PCR)." Nacionalni centar za biotehnološke informacije. Američka nacionalna medicinska knjižnica, n.d. Mreža. 21. veljače 2017.
2. Shendure, Jay i Hanlee Ji. "Sljedeće generacije DNA." Vijesti prirode. Nature Publishing Group, 9. listopada 2008. Web. 21. veljače 2017

Ljubaznošću slike:
1. "PCR koraci" Tinojasontran - Vlastiti rad (Public Domain) putem Commons Wikimedia
2. "Lančana reakcija polimeraze" Enzoklop - Vlastiti rad (CC BY-SA 3.0) putem Commons Wikimedia
3. "DNA slijed" autor Sjef - Vlastiti rad (Public Domain) putem Commons Wikimedia