Razlika između kloniranja i subkloniranja

Ključna razlika - Kloniranje vs subkloniranje
 

Kloniranje i subkloniranje molekularni su biološki postupci koji stvaraju genetski identične stanice ili organizme koji sadrže DNK ili gen koji su od interesa. Kloniranje je tehnika koja uključuje umetanje zainteresiranog gena ili DNK u vektor, njegovu replikaciju u bakteriji domaćinu i proizvodnju stanica ili organizama koji su točne kopije genetskog sastava. Subkloniranje je tehnika koja uključuje umetanje gena od interesa, koji je već umetnut u vektor, u sekundarni vektor, njegovo umnožavanje unutar bakterije domaćina i proizvodnju genetski identičnih kopija stanica ili organizama. Ključna razlika između kloniranja i subkloniranja je u tome, u kloniranju interesni gen nakon vezanja u vektor nastavlja proces kloniranja, dok se u subkloniranju već klonirani interesni gen odvaja od nadređenog vektora i ponovo ubacuje u vektor recipijenta i nastavlja proces.

SADRŽAJ
1. Pregled i ključne razlike
2. Što je kloniranje
3. Što je subkloniranje
4. Usporedna usporedba - kloniranje i subkloniranje
5. Sažetak

Što je kloniranje?

Kloniranje je postupak koji stvara genetski identične organizme ili stanice. U prirodi se kloniranje događa sredstvima aseksualne reprodukcije. Kad nema genetske rekombinacije ili promjene, kćeri stanice dobivaju iste genetske sastave roditelja. Prokariotski i eukariotski organizmi stvaraju klonove binarnom fisijom, pupoljkom, mitozom itd. U molekularnoj biologiji geni za kloniranje ili određeni fragmenti DNA popularna su metoda za proučavanje strukture i funkcije tog određenog dijela DNA.

Glavni je cilj molekularnog kloniranja stvoriti milijune primjeraka genetski identičnih stanica ili organizama koji nose fragment DNA koji nas zanima (uglavnom geni). To stvara organizme s točnim genetskim kopijama drugog. U molekularnim studijama primarno se kloniraju specifični geni kako bi se dobili strukturni i funkcionalni podaci i za sekvenciranje DNA. Također, za proizvodnju specifičnih proteina ili proizvoda u velikom obimu, kloniranje se široko koristi.

Postupak zatvaranja

Osnovni koraci postupka kloniranja su sljedeći.

1. Identifikacija i izolacija gena koji nas zanima. (Amplifikacija gena od interesa PCR-om).
2. Restriktivna probava gena od interesa (Restriction endonuclease smanjio gen).
3. Restriktivna probava vektorske DNA. (Vektorska DNA se također reže pomoću iste restrikcijske endonukleaze).
4. Umetanje gena u vektor i stvaranje rekombinantne molekule.
5. Transformacija rekombinantnog vektora u bakteriju domaćina.
6. Izolacija i identifikacija transformiranih bakterija (plazmidni vektor treba sadržavati gen koji se može selektirati, najčešće gen za rezistenciju na antibiotike na screening transformiranih bakterija).
7. Ekspresija rekombinantnih gena unutar domaćina.

Slika_01: Postupak kloniranja

Što je subkloniranje?

Subkloniranje je postupak premještanja gena od interesa s jednog vektora na drugi da bi se vidjela ekspresija gena za dobivanje željene funkcionalnosti gena. U ovoj metodi su uključena dva vektora; naime, nadređeni i odredišni vektor. Klonirani umeci premještaju se ponovo u drugi vektor u subkloniranju. Cilj prenošenja gena s prvog na drugi vektor je dobiti nešto što prvi vektor ne bi mogao ili odvojiti gen unutar već kloniranog fragmenta DNK i samo ga eksprimirati. U ovom se postupku u početku koriste restriktivni enzimi.

Postupak subkloniranja

Osnovni koraci subkloniranja su sljedeći.

1. Uz pomoć restrikcijskih endonukleaza, odvajanje DNK od interesa u donatorskom plazmidu (roditeljskom vektoru).
2. Pojačavanje DNA od interesa pomoću PCR-a.
3. Pročišćavanje PCR produkta (DNK od interesa) gel elektroforezom.
4. Otvaranje recipijentnog plazmida istim restrikcijskim endonukleazama koje se koriste za odvajanje DNK od interesa u matičnom plazmidu.
5. Ligacija DNA od interesa (gena) u recipijentni plazmid da bi se stvorio subklonirani plazmid.
6. Transformacija subkloniranog vektora u kompetentnu bakteriju domaćina.
7. Screening transformiranih stanica.
8. Pročišćavanje DNA plazmida i korištenje za sekvenciranje DNA ili ekspresiju gena za dobivanje željenih produkata.

Subkloniranje se provodi u slučajevima izolacije jednog gena iz klonirane grupe gena ili kada se gen koji zanima treba prenijeti u koristan plazmid kako bi se vidjela točna funkcija gena od interesa.

Slika_02: Postupak subkloniranja

Koja je razlika između kloniranja i subkloniranja?

Kloniranje vs subkloniranje
Kloniranje je postupak koji stvara genetski identične organizme ili stanice.	Subkloniranje je postupak premještanja gena od interesa s jednog vektora na drugi da bi se vidjela ekspresija gena za dobivanje željene funkcionalnosti gena.
Postupak
Odvojite DNK koji zanima od organizma i jednom ga se ubaci u vektor i klonira	Već klonirana DNA odvojena je od prvog vektora i ubačena u drugi vektor i klonirana.
Umetnite pokret putem Vektora
Ne premješta umetke (DNK od interesa) s jednog na drugi vektor.	Pomicanje umetanja od nadređenog vektora do odredišnog vektora.

Sažetak - Kloniranje vs subkloniranje

Kloniranjem se stvaraju genetski identične stanice ili organizmi s umetnutim genom ili DNK od interesa. Nastaje odvajanjem i umetanjem DNA od interesa u vektor i ekspresiju unutar bakterije domaćina. Subkloniranje dijeli slične korake s kloniranjem. Međutim, u subkloniranju se već klonirani fragment DNA (gen koji zanima) ubacuje u vektor i pretvara u bakteriju domaćina. To je ključna razlika između kloniranja i subkloniranja.

Reference

1. Lodish, Harvey. "Kloniranje DNK vektorima plazmida." Molekularna stanična biologija. 4. izdanje. Američka nacionalna medicinska knjižnica, 01. siječnja 1970. Web. 05. ožujka 2017
2. „Subkloniranja.” Wikipedia. Zaklada Wikimedia, 14. veljače 2017. Web. 06. mar. 2017
3. „Subkloniranja.” Subkloniranje | Članci s otvorenim pristupom | Časopisi s otvorenim pristupom | Zbornik konferencija | Urednici | Autori | Recenzenti | znanstveni događaji. N.p., n.d. Mreža. 06. mar. 2017
4. Wackerhage, Henning. "Kako subklonirati." Kako subklonirati. N.p., 01. siječnja 1970. Web. 06. mar. 2017

Ljubaznošću slika

1. Postupak molekularnog kloniranja - CNX OpenStax [CC BY 4.0], putem Wikimedia Commonsa
2. Postupak subkloniranja - Autor izvornog učitavača bio je Takometer na engleskoj Wikipediji (prebačen iz en.wikipedia u Commons.) [CC BY 2.5], putem Wikimedia Commons