Razlika između RT PCR i QPCR

Ključna razlika - RT PCR u odnosu na QPCR
 

Lančana reakcija polimeraze je tehnika koja se koristi za amplifikaciju određenog dijela DNA in vitro. Zbog pronalaska ove tehnike Karya Mullisa 1983., znanstvenici su u mogućnosti napraviti tisuće do milijune primjeraka specifičnih fragmenata DNK u istraživačke svrhe. Trenutno je to postala uobičajena i rutinski izvedena tehnika u kliničkim i istraživačkim laboratorijima za široku primjenu. Postoje varijacije tradicionalne PCR tehnike poput RT PCR, ugniježđeni PCR, multiplex PCR, Q PCR, RT - QPCR itd. RT PCR i Q PCR dvije su važne varijacije PCR. Ključna razlika između RT PCR i Q PCR je u tome RT PCR se koristi za otkrivanje ekspresije gena stvaranjemkomplementarna DNA (cDNA) transkripte iz RNA dok Q PCR se koristi za kvantitativno mjerenje PCR proizvoda u stvarnom vremenu pomoću fluorescentnih boja.

SADRŽAJ
1. Pregled i ključne razlike
2. Što je RT PCR
3. Što je QPCR
4. Usporedna usporedba - RT PCR u odnosu na QPCR
5. Sažetak

Što je RT PCR?

Lančana reakcija reverzne transkripcije polimerazom (RT PCR) je varijanta PCR koja se koristi za otkrivanje RNA ekspresije. Vrlo je važna metoda za otkrivanje ekspresije mRNA u tkivima. RT PCR se koristi kada je polazni materijal uzorka RNA. U RT PCR, mRNA predloška se najprije pretvara u komplementarnu DNA. Ovaj korak katalizira enzimska reverzna transkriptaza i postupak je poznat kao reverzna transkripcija. Drugo, tradicionalni PCR se koristi za novo sintetiziranu cDNA za amplifikaciju.

RT PCR je vrlo osjetljiva tehnika koja zahtijeva relativno malu količinu RNA uzorka. RT PCR se obično koristi u dijagnostici i kvantifikaciji RNA vrsta, posebno RNA virusa kao što su virus ljudske imunodeficijencije i virus hepatitisa C.

Slika 01: RTR tehnika

Što je QPCR?

Kvantitativni PCR (QPCR) je inačica PCR-a koja se koristi za kvantitativno mjerenje PCR proizvoda. Također se naziva i lančanom reakcijom polimeraze u stvarnom vremenu jer mjeri pojačavanje u stvarnom vremenu pomoću PCR stroja u stvarnom vremenu. To je pogodna metoda za određivanje količine ciljne sekvence ili gena prisutnog u uzorku. Zanimljiva značajka QPCR-a je ta da on kombinira i pojačavanje i istinsku kvantifikaciju u jedan korak. Stoga se potreba za elektroforezom gela u otkrivanju može otkloniti tehnikom QPCR. QPCR koristi fluorescentne boje za označavanje PCR proizvoda tijekom PCR reakcija koje na kraju dovode do izravnog kvantifikacije. Kad se PCR proizvodi akumuliraju, fluorescentni signali se također akumuliraju i to će mjeriti stroj u stvarnom vremenu. QPCR se može kombinirati s RT PCR. Poznat je kao RT - QPCR ili QRT - PCR i smatra se najmoćnijom, osjetljivom i kvantitativnom metodom za otkrivanje razine RNA u stanicama ili tkivima.

SYBR Green i Taqman dvije su metode koje se koriste za otkrivanje ili gledanje procesa amplifikacije PCR-a u stvarnom vremenu. SYBR Green metoda provodi se korištenjem fluorescentne boje zvane SYBR green i otkriva pojačavanje vezanjem boje za proizvodnju dvolančane DNA. Taqman se provodi pomoću dvostruko označenih sondi i detektira pojačavanje degradacijom sonde pomoću Taq polimeraze i oslobađanje fluorofora kao što je prikazano na slici 02. Obje metode prate napredak postupka amplifikacije i izvještavaju o količini proizvoda u stvarnom vremenu.

PCR u stvarnom vremenu ima široku paletu aplikacija kao što su kvantifikacija gena ekspresije, analiza mikroRNA i nekodirajuća RNA, SNP genotipizacija, otkrivanje varijanti broja kopija, detekcija rijetkih mutacija, detekcija genetski modificiranih organizama, detekcija infektivnih uzročnika itd..

Slika 02: Kvantitativna PCR tehnika

Koja je razlika između RT PCR i QPCR?

RT PCR vs QPCR
RT PCR je tehnika koja se koristi za otkrivanje ekspresije gena amplifikacijom.	QPCR je tehnika koja povećava DNK i kvantificira PCR proizvode u stvarnom vremenu.
Uključivanje enzima obratne transkriptaze
Enzimska reverzna transkriptaza koristi se za RT PCR.	Enzimska reverzna transkriptaza se ne koristi za QPCR.
Upotreba fluorescentno označenih molekula
Ne upotrebljavaju se fluorescentno označene boje ili sonde za RT PCR.	Za QPCR koriste se fluorescentno označene boje ili sonde.
Kvantifikacija PCR produkta
Ako nije spojen s QPCR-om, RT PCR ne kvantificira PCR proizvod.	QPCR kvantitativno mjeri PCR proizvod.
Polazni materijal
Polazni materijal je mRNA.	Polazni materijal je DNK.
Sinteza cDNA
Komplementarna DNA nastaje tijekom RT PCR-a.	Komplementarna DNA se ne proizvodi tijekom QPCR.

Sažetak - RT PCR u odnosu na QPCR

RT PCR i QPCR dvije su verzije tradicionalnog PCR-a. RT PCR tehnika se izvodi za uzorke mRNA, a pokreće se reverznom transkripcijom i proizvodnjom cDNA. QPCR se koristi za kvantificiranje PCR proizvoda tijekom PCR toplinskih ciklusa u stvarnom vremenu pomoću fluorescentnih boja ili označenih sondi. U QPCR-u, količina PCR proizvoda predstavljena je emitiranim fluorescentnim signalima u uzorku. RT PCR se popularno koristi kao proces pojačanja, dok se QPCR obično koristi kao postupak kvantifikacije. Ovo je razlika između RT PCR i QPCR.

Reference:
1. Deepak, SA, KR Kottapalli, R. Rakwal, G. Oros, KS Rangappa, H. Iwahashi, Y. Masuo i GK Agrawal. "PCR u stvarnom vremenu: revolucionarna detekcija i analiza ekspresije gena." Trenutna Genomika. Bentham Science Publishers Ltd., lipanj 2007. Web. 03. april 2017
2. Zeka, Fjoralba, Katrien Vanderheyden, Els De Smet, Claude A. Cuvelier, Pieter Mestdagh i Jo Vandesompele. „Ravna i osjetljiva analiza ekspresije gena FFPE temeljena na RT-qPCR.“ Vijesti prirode. Nature Publishing Group, 22. veljače 2016. Web. 03. april 2017
3. Overbergh, L., A. Giulietti, D. Valckx, B. Decallonne, R. Bouillon i C. Mathieu. "Upotreba PCR-a obrnute transkriptaze u realnom vremenu za kvantifikaciju ekspresije gena citokina." Časopis za biomolekularne tehnike: JBT. Udruženje biomolekularnih resursa, ožujak 2003. Web. 03. april 2017

Ljubaznošću slike:
1. "Taqman" Korisnik: Braindamaged - Vlastito djelo izvornog učitavača (Public Domain) putem Commons Wikimedia
2. "Lančana reakcija reverzne transkripcije polimerazom" napisao Jpark623 - Vlastiti rad (CC BY-SA 3.0) preko Commons Wikimedia